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雷电竞技-实验室常用微生物菌种的分离和纯化方法

点击量: 246     作者: 雷电竞技     时间: 2022-03-29 20:12:07

从稠浊微生物群体中取得只含有某一种或某一株微生物的进程称为微生物分手与纯化。在份子生物学的研究和利用中,不但需要经由过程分手纯化手艺从稠浊的自然微生物群平分离出特定的微生物,并且还必需随时留意连结微生物纯培育物的“纯正”,避免其他微生物的混入。

1、用固体培育基分手和纯化

单个微生物在适合的固体培育基概况或内部发展、滋生到必然水平可以构成肉眼可见的、有必然形态布局的仔细胞发展群体,称为菌落。当固体培育基概况浩繁菌落连成一片时,便成为菌苔。分歧微生物在特定培育基上发展构成的菌落或菌苔一般都具有不变的特点,可以成为对该微生物进行分类、判定的主要根据。年夜大都细菌、酵母菌、和很多真菌和单细胞藻类能在固体培育基上构成孤立的菌落,采取适合的平板分手法很轻易获得纯培育。所谓平板,即培育平板的简称,它是指固体培育基倒入无菌平皿,冷却凝固后,盛固体培育基的平皿。这方式包罗将单个微生物分手和固定在固体培育基概况或里面。固体培育基用琼脂或其它凝胶物资固化的培育基,每一个孤立的活微生物体发展、滋生构成菌落,构成的菌落便在移植。zui经常使用的分手、培育微生物的固体培育基是琼脂固体培育基平板。这类由Kock成立的采取平板分手微生物纯培育的手艺简洁易行,100多年来一向是各类菌种分手的zui经常使用手段。

1.1 稀释倒平板法

起首把微生物悬液作一系列的稀释(如1:10、1:100、1:1000、1:10000),然后别离取分歧稀释液少量,与已融化并冷却至50℃摆布的琼脂培育基夹杂,摇匀后,倾入灭过菌的培育皿中,待琼脂凝固后,制成可能含菌的琼脂平板,保温培育必然时候便可呈现菌落。假如稀释适当,在平板概况或琼脂培育基中便可呈现分离的单个菌落,这个菌落可能就是由一个细菌细胞滋生构成的。随后挑取该单个菌落,或反复以上操作数次,即可获得纯培育。

1.2 涂布平板法

由于将微生物悬液先加到较烫的培育基中再倒平板易造成某些热敏感菌的灭亡,且采取稀释倒平板法也会使一些严酷好氧菌因被固定在琼脂中心缺少氧气而影响其发展,是以在微生物学研究中经常使用的纯种分手方式是涂布平板法。其做法是先将已融化的培育基倒入无菌平皿,制成无菌平板,冷却凝固后,将必然量的微生物悬液滴加在平板概况,再用无菌玻璃涂棒将菌液平均分离至全部平板概况,经培育后挑取单个菌落(图1)。

实验室常用微生物菌种的分离和纯化方法

图1 涂布平板法

1.3平板划线法

zui简单的分手微生物的方式是平板划线法,即用接种环以无菌操作沾取少量待分手的材料,在无菌平板概况进行持续划线(图2),微生物细胞数目将跟着划线次数的增添而削减,并慢慢分离开来,假如划线适合的话,微生物能逐一分离,经培育后,可在平板概况获得单菌落。有时这类单菌落并不是都由单个细胞滋生而来的,故必需频频分手屡次才可获得纯种。其道理是将微生物样品在固体培育基概况屡次作“由点到线”稀释而到达分手目标的。划线的方式良多,常见的比力轻易呈现单个菌落的划线方式有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。

实验室常用微生物菌种的分离和纯化方法

图2 平板划线法

1.4 稀释摇管法

用固体培育基分手严酷厌氧菌有非凡性,假如该微生物表露在空气中不当即灭亡,可以采取凡是的方式制备平板,然后置放在封锁的容器中培育,容器中的氧气可采取化学、物理或生物的方式断根。对那些对氧气更加敏感的厌氧性微生物,纯培育的分手则可采取稀释摇管培育法进行,它是稀释倒平板法的一种变通情势。先将一系列盛无菌琼脂培育基的试管加热使琼脂融化后冷却并连结在50℃摆布,将待分手的材料用这些试管进行梯度稀释,试管敏捷摇动平均,冷凝后,在琼脂柱概况倾倒一层灭菌液体白腊和固体白腊的夹杂物,将培育基和空气离隔。培育后,菌落构成在琼脂柱的中心。进行单菌落的挑取和移植,需先用一只灭菌针将液体白腊--白腊盖掏出,再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间,吹入无菌无氧气体,将琼脂柱吸出,置放在培育皿中,用无菌美金将琼脂柱切成薄片进行不雅察和菌落的移植。

2、用液体培育基分手和纯化

年夜大都细菌和真菌,用平板法分手凡是是满足的,由于它们的年夜大都种类在固体培育基上长得很好。但是迄今为止其实不是所有的微生物都能在固体培育基上发展,例如一些细胞年夜的细菌、很多原活泼物和藻类等,这些微生物仍需要用液体培育基分手来取得纯培育。

稀释法是液体培育基分手纯化经常使用的方式。接种物在液体培育基中进行挨次稀释,以获得高度稀释的结果,使一支试管平分配不到一个微生物。假如经稀释后的年夜大都试管中没有微生物发展,那末有微生物发展的试管获得的培育物可能就是纯培育物。假如经稀释后的试管中有微生物发展的比例提高了,获得纯培育物的机率就会急剧降落。是以,采取稀释法进行液体分手,必需在统一个稀释度的很多平行试管中,年夜大都(一般应跨越95%)表示为不发展。

3、单细胞(胞子)分手

只能分手出稠浊微生物群体中占数目优势的种类是稀释法的一个主要错误谬误。在天然界,良多微生物在稠浊群体中都是少数。这时候,可以采纳显微分手法从稠浊群体中直接分手单个细胞或单个个别进行培育以取得纯培育,称为单细胞(或单胞子)分手法。单细胞分手法的难度与细胞或个别的巨细成反比,较年夜的微生物如藻类、原活泼物较轻易,个别很小的细菌则较难。

较年夜的微生物,可采取毛细管提取单个个别,并在年夜量的灭菌培育基中转移清洗几回,除去较小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜,如剖解显微镜下进行。对个别相对较小的微生物,需采取显微操作仪,在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或胞子以取得纯培育。在没有显微操作仪时,也可采取一些变通的方式在显微镜下进行单细胞分手,例如将经恰当稀释后的样品制备成小液滴在显微镜下不雅察,拔取只含一个细胞的液体来进行纯培育物的分手。单细胞分手法对操作手艺有比力高的要求,多限在高度专业化的科学研究中采取。

4、选择培育分手

没有一种培育基或一种培育前提可以或许知足一切微生物发展的需要,在必然水平上所有的培育基都是选择性的。假如某种微生物的发展需如果已知的,也能够设计特定情况使之合适这类微生物的发展,因此可以或许从稠浊的微生物群体中把这类微生物选择培育出来,虽然在稠浊的微生物群体中这类微生物可能只占少数。这类经由过程选择培育进行微生物纯培育分手的手艺称为选择培育分手,特殊合用在从天然界平分离、寻觅有效的微生物。天然界中,在年夜大都场所微生物群落是由多种微生物构成的,从平分离出所需的特定微生物是好不容易的,特别当某一种微生物所存在的数目与其它微生物比拟很是少时,单采取一般的平板稀释法几近是不成能的。要分手这类微生物,必需按照该微生物的特点,包罗营养、心理、发展前提等,采取选择培育分手的方式。或按捺使年夜大都微生物不克不及发展,或造成有益在该菌发展的情况,颠末必然时候培育后使该菌在群落中的数目上升,再经由过程平板稀释等方式对它进行纯培育分手。

4.1 操纵选择平板进行直接分手

按照待分手微生物的特点选择分歧的培育前提,有多种方式可以采取。例如要分手高温菌,可在高温前提下进行培育;要分手某种抗菌素抗性菌株,可在加有抗菌素的平板长进行分手;有些微生物如螺旋体、粘细菌、蓝细菌等能在琼脂平板概况或里面滑行,可以操纵它们的滑动特点进行分手纯化,由于滑行能使它们本身和其它不克不及移动的微生物分隔。可将微生物群落点种到平板上,让微生物滑行,从滑行前沿挑取接种物接种,频频进行,获得纯培育物。

4.2 富集培育

富集培育法道理和方式很是简单,操纵分歧微生物间生命勾当特点的分歧,制订特定的情况前提,使仅顺应在该前提的微生物兴旺发展,从而使其在群落中的数目年夜年夜增添,很轻易地分手到所需的特定微生物。富集前提可按照所需分手的微生物的特点从物理、化学、生物、和综合多个方面进行选择,如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等很多方面。在不异的培育基和培育前提下,颠末屡次反复移种,zui后富集的菌株很轻易在固体培育基上长出单菌落。假如要分手一些专性寄生菌,就必需把样品接种到响应敏感宿主细胞群体中,使其年夜量发展。经由过程屡次反复移种即可以获得纯的寄生菌。

5、二元培育物

分手的目标凡是是要获得纯培育。但是,在有些环境下这是很难做到的。但可用二元培育物作为纯化培育的替换物。含有二种以上微生物的培育物称为夹杂培育物,而假如培育物中只含有二种微生物,并且是成心识的连结两者之间的特定关系的培育物称为二元培育物。例如二元培育物是保留病毒的zui有用路子,由于病毒是细胞生物的严酷的细胞内寄生物。有一些具有细胞的微生物也是严酷的其它生物的细胞内寄生物,或非凡的共生关系。对这些生物,二元培育物是在尝试室节制前提下可能到达的zui接近在纯培育的培育方式。别的,猎食藐小微生物的原活泼物也很轻易用二元培育法在尝试室培育,培育物由原活泼物和它猎食的微生物两者构成。例如,纤毛虫、变形虫和粘菌。

在以上介绍的几种方式中,平板分手法遍及用在尝试室微生物的分手与纯化。微生物在固体培育基上发展构成的单个菌落,凡是是由一个细胞滋生而成的调集体。是以可经由过程挑取单菌落而取得一种纯培育。获得单个菌落的方式可经由过程稀释涂布平板或平板划线等手艺完成。值得指出的是,从微生物群体中经分手发展在平板上的单个菌落其实不必然包管是纯培育。是以,纯培育简直定除不雅察其菌落特点外,还要连系显微镜检测个别形态特点后才能肯定,有些微生物的纯培育要颠末一系列分手与纯化进程和多种特点判定才能获得。

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